项目名称：甲型H1N1流感病原学研究及其在流感大流行防控中的应用

完成单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（第一完成单位）

北京金豪制药股份有限公司

完成人：舒跃龙、王大燕、张誌、徐翠玲、高荣保、温乐英、白天、周剑芳、张彦平、曹健荣、李晓丹、张陆明、赵翔、李希妍、王伟

一、项目概况：

1、项目起止时间：

起始时间：2009年4月25日

完成时间：2011年4月6日

2、项目资助：

（1）国家科技重大专项课题：传染病预测预警全息模型的建立与应用（2008ZX10004－013）

（2）973计划：甲型H1N1等流感病毒重配与变异研究（2010CB534001）

（3）973计划：流感病毒免疫保护机理研究（2010CB534004）

（4）国家自然科学基金委主任基金：甲型H1N1流感的疫苗研发以及跨种传播的机制研究（30950002）

（5）国家科技支撑计划：快速检测产品和技术评价与研发（2009BAKYJ002）

（6）2009年国家甲流应对专项任务

3、国内外研究进展：

2009年4月底，美国和墨西哥报道了甲型H1N1流感疫情，这种新甲型H1N1病毒的基因组成是从未在人流感病毒或猪流感病毒中发现过的一种新的类型。

对于这种新型流感病毒，国内外均无现成的获批的检测试剂盒，迫切需要建立甲型H1N1流感病毒的诊断方法，并且该方法不仅要具有很高的灵敏度，更重要的是要能够区别出当时人群中流行的其它流感病毒。

疫情初期，对于该病毒的传播力、致病性全球都无明确答案，因此导致最初从墨西哥得到的有限资料甚至认为其病死率超过了SARS，一度引起国际社会的恐慌。因此需要对病毒的致病性，人群易感性，疾病负担等方面迅速开展相关研究，为科学防控甲流提供依据。

2009甲型H1N1流感流行初期，为评估其可能带来的风险，多个国家和地区对人群既往的血清学本底进行了研究，结果显示不同国家和地区人群的抗体水平不同。英国利用2008年的血清，检测其中2009甲型H1N1流感的抗体水平，结果显示15岁以下的青少年中有3％，65岁以上成人中有23％有针对2009甲型H1N1流感病毒的抗体。美国对2006－2008年的血清学分析结果显示大约11％无疫苗接种史的人群具有针对2009甲型H1N1流感病毒的抗体，而且在老年人群的阳性率达到33％；在日本仅1920年前出生的人群存在针对甲型H1N1病毒的预存抗体。不同地域存在的差别可能与不同人群既往的疫苗接种史和既往感染史有关。

4、研究目的与方法：

本项目是在国家应对甲流疫情的关键时刻，围绕疫情输入前、大流行和流行后不同阶段国家甲型H1N1流感联防联控的需求开展研究。在疫情随时传入我国，而对该病一无所知的情况下，率先开展诊断技术研究。在疫情传入我国之后，针对国家联防联控策略制定所需要的关键需求，系统开展病毒变异、流行病学以及病毒的致病和免疫机制等方面的研究，为疫情形势研判、防控策略的制定提供及时的重要科学依据和关键技术手段。

技术方法：

（1）建立检测方法并开发临床诊断试剂盒。

利用数据库对甲型H1N1流感病毒序列特点进行分析→设计甲型H1N1流感病毒特异性荧光PCR引物和探针→筛选和优化可以高效工作的甲型H1N1流感病毒特异性荧光PCR引物和探针→完成甲型H1N1流感病毒检测试剂盒的实验室开发→建立产品的生产工艺和试生产→临床应用试验研究→在完善期内对产品进行进一步优化→试生产三批进行注册检验→申报医疗器械注册证（生产文号）→实现产品产业化，满足社会的诊断要求。

（2）流感病毒抗原性，基因特性及耐药性研究。

通过全国556家流感监测哨点医院每周报告流感样病例数据并采集标本，通过411家流感监测网络实验室开展标本检测和病毒分离，同时将病毒标本送往中国疾控中心病毒病所国家流感中心进行进一步的分析。国家流感中心通过抗原分析和全基因组序列测定，持续不断地实时了解病毒的变异情况。通过耐药性分析实时了解病毒的耐药情况。

2．1实时监测甲流病毒检测阳性率和变化趋势，掌握甲型H1N1流感病毒在我国的流行程度。通过分析，确定2009年6月底甲流在我国广泛流行、11月底流行达到顶峰，之后迅速下降，2010年1月之后第一个流感大流行高峰结束。

2．2对分离自各省的600余株甲流病毒进行了全基因组序列分析，利用标准血清和标准抗原，对4000余株甲流病毒进行了抗原性分析，发现甲流病毒未发生重配以及与致病力改变相关的变异。通过对甲流病毒的耐药位点进行分析以及生物学耐药检测，所有甲流病毒对烷胺类药物耐药，但对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感。

（3）通过全国范围的血清学调查研究，确定我国的甲流易感人群以及第一次流行高峰所导致的疾病负担。

3．1对2006－2008年采自我国5个省，各年龄组的2439份血清，采用血凝抑制（HI）方法和微量中和（MN）方法，测定各年龄组甲型H1N1流感病毒交叉保护抗体水平。

3．2对2007－2008、2008－2009年收集的季节性流感病毒疫苗接种人群的血清标本，采用血凝抑制（HI）方法和微量中和（MN）方法，检测季节流感疫苗接种是否会对甲型H1N1流感病产生交叉保护。

3．3为了解第一次流感大流行高峰之后的所产生的疾病负担以及为将来的疫情预测提供科学依据，我们于2010年1月开始采用多阶段分层随机抽样方法开展了全国血清学调查。随机抽取包括北京在内的10个省参与调查，每个省份调查人群分为三个地区分层（省会城市、中小城市、农村）和5个年龄分组（0～5、6～15、16～24、25～59、≥60），为了保证能够准确评估每个省份每个地区分层的每个年龄组样本量为300人，设计每省调查4500人，全国调查49，500人（实际调查到50，111人）。在10个省份调查单位地级市、县区、乡镇街道、村居委会、调查对象个体逐级进行随机抽取。采集调查对象静脉血采用血凝抑制试验（HI）进行甲流病毒的抗体检测。

（4）开展甲流病毒免疫机制和致病机制研究。

4．1为快速、安全评价NK细胞对不同来源的流感病毒的应答，在甲流流行初期，利用季节性H1N1亚型、H3N2亚型、1918年H1N1大流行病毒、2009甲流病毒和H5N1病毒的假病毒颗粒体外刺激人外周血NK细胞，检测NK细胞对流感病毒HA/NA的有效应答，研究对不同亚型的流感病毒的反应强度。该研究推进了对流感病毒致病机制的认识［JVirol．84：7822－31］。

4．2病毒感染A549细胞后基因谱表达差异分析：与季节性H1N1流感比较，青壮年患甲流的病死率更高，我们以A/California/07/2009（H1N1）和A/Baoan/51/2008（H1N1）分别作为甲流及季节性H1N1流感的代表株，体外研究A549细胞在这两类病毒感染后基因谱的变化。［BiomedEnvironSci2010，23：259－66］．

4．3甲流免疫策略研究：人群中已流行的季节性流感是否对甲流病毒存在交叉性的免疫保护，还是机体会出现抗原原罪效应，即体内已有的季节性流感抗原可能会降低对甲流疫苗的免疫应答。2009年10月，甲流在我国第一波流行高峰期间，我们将150名健康受试者，分为三组，每组50人。第一组同时接种甲型H1N1流感裂解疫苗和季节性流感疫苗；第二组先接种甲型H1N1流感裂解疫苗，第21天接种季节性流感疫苗；第三组先接种季节性流感疫苗，第21天接种甲型H1N1流感裂解疫苗。研究机体的细胞和体液免疫应答以及免疫策略对免疫应答的影响。［Vaccine2011，29（5）：1009－16．］

二、项目研究结果和结论：

1、建立检测方法并开发临床诊断试剂盒

（1）率先研制成功优于WHO推荐的检测试剂的高灵敏度和特异性的甲流病毒核酸检测试剂，并最先在全国多个系统和部门广泛应用，首批通过了国家科技部组织的甲型H1N1流感试剂盒测评，成为联防联控工作机制推荐使用的甲型H1N1流感检测试剂盒。并获得我国首个由国家食品药品监督管理局正式颁发的批准文号。

2、甲流病毒抗原性，基因特性及耐药性研究

（1）通过病原学研究，表明甲型H1N1流感病毒是由国外传入我国，而不是起源于我国。而且病毒在我国的流行并没有改变其抗原性，流行病毒与世界卫生组织（WHO）推荐疫苗株高度同源，未发现病毒的重配以及与致病力改变相关的变异，表明接种疫苗有效。通过对甲流病毒的耐药位点进行分析以及生物学耐药检测，所有甲流病毒对烷胺类药物耐药，但对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感，为临床用药提供了科学依据。

3、甲流病毒血清学和疾病负担研究

（1）研究显示，我国各年龄组人群对甲型H1N1流感病毒交叉保护抗体很低，仅为1．2％，表明人群对甲流普遍易感。从血清学研究表明，季节性流感疫苗对甲型H1N1流感交叉保护作用很少。

（2）通过全国大规模血清学调查研究，通过调查研究，估计我国全人群甲型H1N1流感抗体阳性率为21．5％。排除甲流疫苗接种人群的普通人群抗体阳性率为17．1％，发病率为15．9％。研究表明表明我国超过98％的人群对甲型H1N1流感病毒易感，一次流感大流行，导致我国共有2．07亿人感染，其中约1亿人发病。

4、甲流病毒免疫机制和致病机制研究。

（1）研究表明NK细胞对流感病毒HA/NA能有效应答，以细胞活化、细胞毒效应为主，即CD69和CD107a表达增加，γ－干扰素和细胞毒功能增强，这类反应在不同的NK细胞亚群不同，以主要发挥杀伤效应的CD56^dimNK应答为主，对不同亚型的流感病毒反应强度也不同，发现H3N2，2009甲流病毒所激发的NK反应明显低于1918H1N1病毒及H5N1病毒，且随病毒颗粒增加，NK细胞的活化、细胞毒效应减弱，反应呈剂量依赖性。

（2）甲流病毒和季节性H1N1病毒感染A549细胞后，8小时和24小时后与免疫应答相关的基因表达下调，包括toll样受体信号途径、参与抗原加工提呈、T/B细胞信号转导途径及细胞因子受体相关的基因，甲流感染后引起的基因表达抑制没有季节性流感病毒的强。此外，这两类病毒感染后可激发宿主细胞出现抗凋亡基因的活化及表达上调，而季节性流感病毒所激发的抗凋亡能力更强。

（3）研究表明机体存在对甲流病毒的记忆性交叉反应性T细胞。发现首先接种甲流灭活疫苗能诱导对甲流病毒高水平的抗体应答，而先免疫季节性流感疫苗，21天后再免疫甲流疫苗，诱导产生对甲流病毒的抗体水平较低（p<0．05），同时接种甲流疫苗和季节性流感疫苗诱导产生的对甲流病毒的抗体水平明显低于首先接种甲流疫苗组。为疫苗免疫策略研究提供了依据。

三、项目推广应用情况：

1、利用建立的技术方法，确诊了我国首例甲型H1N1流感病例，分离到我国第一株甲型H1N1流感病毒，得到我国第一株甲型H1N1流感病毒全基因组序列。

2、甲型H1N1流感病毒检测方法及其诊断试剂广泛应用于我国检验检疫部门、各级疾控中心以及各医疗机构。为前期的围堵以及疫情应对中的病例诊断提供了技术手段。截止2010年10月，全国流感监测网络实验室利用建立起来的检测技术，检测了45万余份临床流感样病例标本，对2000余起流感样病例暴发疫情进行了病原学鉴定，其中1800余起经实验室检测确定为甲型H1N1流感暴发，共确诊甲流病人128，156例，其中死亡805例。

3、向泰国、菲律宾、古巴等13个国家和地区提供了检测试剂和技术培训，为这些国家的甲流防控提供了技术支持，提高了我们的国际地位和影响力。

4、为我国制定《甲型H1N1流感实验室检测技术》、《甲型H1N1流感监测指南》、《甲型H1N1流感诊疗方案》以及《甲型H1N1流感疫苗接种方案》提供了科学依据。

5、为评估甲流在我国所造成的疾病负担提供了科学数据。

6、本项目的研究结果分别在2009年召开的“流感大流行国际研讨会”、“第3届西太区和东南亚区流感中心会议”以及2010年召开的“流感国际大会”、“流感大流行国际研讨会”等国际会议上进行交流。

7、人才培养情况：通过本项目，提高和锻炼了专业人员的专业水平培养了专业技术人才队伍，培养硕士研究生5名，博士后1名。