项目名称：中国麻疹疫苗株与野病毒株快速诊断方法及麻疹病毒变异研究

完成单位：吉林省疾病预防控制中心

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

完成人：周剑惠、许文波、侯祥、陈超、张燕、王爽、常新、田鑫

一、项目概况：

项目起止时间：2004．1．1－2010．12．30

项目资助：

本研究在科技部重大专项传染病监测技术平台合作项目、吉林省科技发展计划项目、吉林省卫生厅病毒重点实验室课题等基金支持下完成。

国内外研究进展：

国内外常见的非常传统的鉴定麻疹病毒基因型以及鉴别麻疹病毒疫苗株和野病毒株的方法是基因序列分析方法。除本研究外，国内外尚未发现有将H1基因型麻疹野病毒区分与其它23种基因型麻疹野病毒的快速诊断方法的报道。据文献报道，日本曾经利用RT－PCR－RFLP技术鉴别日本疫苗株与日本野病毒的方法，但仅适用于日本的疫苗株和日本本土野病毒株的鉴定，国内也曾有利用RT－PCR－RFLP技术鉴别沪191疫苗株和H1基因型麻疹病毒的报道，但本研究所建立的基于能够将中国两种麻疹疫苗株（沪191和长47）区分于世界上所有24种基因型麻疹野病毒的快速鉴别方法尚未见报道，同时，本研究首先将该方法成功应用于接种麻疹后麻疹样病例的诊断。日本建立了新的麻疹病毒核酸检测方法－环介导等温扩增核酸方法（LAMP），本研究在中国率先引进麻疹LAMP技术并进行了成功应用。国内外有关麻疹病毒基因特征和抗原性研究的文献很多，本研究首次阐明了吉林省历年麻疹病毒血凝素蛋白编码基因和核蛋白部分基因的变异规律和趋势、确证了较低水平的麻疹病毒中和抗体（1：4）不能完全保护H1基因型麻疹野病毒的侵袭。

研究目的与方法

我国已向WHO承诺在2012年要消除麻疹，随着麻疹消除目标的接近，快速鉴别麻疹野病毒的来源是本土还是输入、及时监测麻疹野病毒基因及抗原变异趋势以及快速鉴定麻疹疫苗相关病例等科学需求日益突出。针对上述科学问题，本研究通过病毒学监测、基因序列测定和分析、关键酶切位点确定、微量细胞病变中和实验等技术，在麻疹病毒血凝素蛋白基因上筛选出能够将中国麻疹疫苗株（沪191和长47）区分于世界上所有24种麻疹野病毒基因型的限制性内切酶酶切位点，并据此酶切位点设计引物，建立了中国麻疹疫苗株与24种基因型野毒株快速鉴别方法（RT－PCR－RFLP），并成功应用该方法快速确证了接种麻疹减毒活疫苗第9天出现的麻疹样病例为H1基因型麻疹野病毒感染所致，非麻疹疫苗相关病例；在麻疹病毒血凝素蛋白基因上筛选出能够将中国麻疹病毒优势基因型H1基因型区分于世界上其它23种基因型麻疹野病毒的限制性内切酶酶切位点，并据此酶切位点建立了中国麻疹病毒优势基因型H1的RT－PCR－RFLP快速诊断方法；研究比较了麻疹病毒血凝素蛋白基因及氨基酸的变异状况及抗原差异；从国外引进并应用了环介导等温扩增麻疹病毒核酸技术（LAMP方法）。

二、项目研究结果和结论：

1、本研究所建立的针对中国麻疹野病毒优势基因型H1的快速诊断方法（RT－PCR－RFLP）为国内外首次建立和应用，本方法的建立及成功应用对全国麻疹疫情的快速诊断以及中国麻疹病毒流行株基因型的快速筛查具有重要意义。

2、本研究所建立的能够将中国麻疹疫苗株（沪191和长47）区分于世界上所有24种基因型麻疹野病毒的快速诊断方法（RT－PCR－RFLP）为国内外首次建立和应用，该方法的建立及应用对全国接种麻疹疫苗后麻疹样病例的诊断提供了有力的技术支撑，尤其对消除麻疹阶段病例的诊断具有重要意义。

3、在中国率先引进并应用了新的麻疹核酸检测方法－环介导等温扩增核酸方法（LAMP）方法，该方法只需一个水浴箱即可替代PCR仪进行等温核酸扩增，为基层实验室快速鉴定麻疹爆发疫情或散发病例提供了敏感、特异和便捷的方法。

4、本研究发现了自2001年以来吉林省麻疹野病毒血凝素蛋白基因的变异在逐年增加、逐年积累，2009年所有吉林省麻疹病毒核蛋白基因均在抗原表位457位点出现了氨基酸突变；阐明了吉林省麻疹病毒血凝素蛋白编码基因和核蛋白部分基因的变异规律和趋势；确证了较低水平的麻疹病毒中和抗体（1：4）不能完全中和我国本土流行的H1基因型和其他国家流行的多个基因型麻疹病毒。

上述研究成果为我国实现消除麻疹或消除麻疹阶段的维持提供了重要的科学手段和科学依据。

三、项目推广应用情况：

本研究建立的“中国麻疹病毒优势基因型快速诊断方法”自2004年初步建立到目前省内外的成熟应用已历经7年，7年间吉林省疾控中心应用该方法对366份疑似麻疹临床咽拭子标本和63株麻疹病毒分离株进行了鉴定，目前，该方法已在全国省内外20个实验室得到验证和应用，全国各地实验室应用该方法对当地2007－2010年不同年代流行的约186株麻疹病毒进行了鉴定，结果均证明该方法快速敏感特异，与基因序列方法的符合性为100％。

本研究建立的“中国麻疹疫苗株与野病毒株鉴别方法”自2008年建立，成功确证了吉林省接种麻疹疫苗后第9天出现麻疹样病例为麻疹野病毒感染引起的偶合病例而非疫苗相关病例。目前，该方法已在全国14个省对约70余株麻疹病毒流行株进行了验证，验证结果证实该方法能够成功鉴别中国麻疹疫苗株和各地流行的野病毒株，与基因序列方法的符合性为100％。

本研究成果两种RT－PCR－RFLP方法的核心技术已经转化为产业化生产，成品试剂盒已经供应到全国31个省用于H1基因型麻疹野病毒的诊断以及麻疹疫苗相关病例的诊断。