项目名称：我国高致病性2型猪链球菌分离鉴定、检定分型及分子致病机理的研究

完成单位：中国人民解放军南京军区疾病预防控制中心；中国科学院微生物研究所；中国人民解放军第三军医大学

完成人：唐家琪，高福，胡福泉，王长军，潘秀珍，冯友军，李明，王忠灿，郑峰，王晶，张强敏，操敏

一、项目概况

项目起止时间：1998年9月至2010年12月。

项目资助：“十五”国家重大传染病科技攻关计划项（2003BA712A03－05）、“863”（2006AA0Z455）、国家“973”（2006CB504400）、国家重大支撑计划、国家自然基金重点和面上（30730081、30670105、30600533、30671848、30972638），“十一五”全军医药卫生科技攻关课题（06G039）、“十五”南京军区医药卫生重点课题（02Z007）、。

国内外研究进展：猪链球菌2型（SS2）是革兰阳性兼性厌氧球菌，是重要的人兽共患病病原体，可引起猪和人的脑膜炎、关节炎及败血症等严重疾患。SS2呈全球性流行，加拿大、美国、丹麦、荷兰等国都曾多次发生流行。我国于1990年后在广东、湖北、江苏、四川等南方省份的猪群中经常有此病流行，目前已形成地方性自然疫源地，严重危害我国猪养殖业，每年造成的直接经济损失达数亿元。特别是近10多年来，这种原本主要在猪群中流行的重要猪传染病竟然在人群中暴发，先后在我国引发两起重大公共卫生事件，临床上有高比例病人发生中毒性休克综合征（STSS），其特点是以急起高热发病，迅速出现全身大面积出血和瘀斑、休克、多脏器衰竭等，病程极为凶险，抗生素治疗无法挽救STSS患者生命，病人多数在发病1～3日内死亡，病死率达80％以上，上述情况国内外从未见报道。SS2所致STSS已作为新发传染病列入国家传染病监控清单。关于SS2致病因子和机理，国外研究较多的主要包括荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、胞外因子和溶血素等。但总体而言，基于单一毒力因子的研究尚不能对SS的致病作用给予全面、客观、合理的解释，尤其是无法阐明我国SS2流行株引发高病死率STSS这一新病型的发病机制。

研究目的与方法：课题组采用了病理学、免疫学、比较基因组学、蛋白质组学、反向遗传学以及基因敲除、基因芯片、多重PCR、二维电泳、晶体解析、体内诱导表达等分子生物学技术，围绕我国高致病性SS2引发STSS的分子机理开展了系统深入的研究，以期解析高致病性和发生STSS的分子机理，为SS2分子疫苗研制、药物筛选等寻找靶位，为该病预防、诊断、治疗提供技术和生物材料。

二、项目研究结果和结论

1．发现新现高致病性病原菌及其引起的新病型在两起不明病因的重大公共卫生事件（1998年江苏和2005年四川）现场分离到病原并鉴定为SS2。感染者出现了从未报导过的STSS这一新临床类型，抗生素治疗仍不能挽救生命，病死率达80％以上，表明我国SS2因毒力变异产生高致病菌株。研究结果发表于PLoSMed（IF15．62），杂志同期刊登了国外知名专家的重要评述。

2．发现89K毒力岛样结构SS2两次暴发现场分离的高致病株基因组都携带独特的89K核酸序列，而国内外其他有毒株和无毒株均未能测到该序列，该岛样结构内含有来自多种病菌的毒力元件，符合病原细菌毒力岛的基本特征（PLoSOne，IF4．41）。

3．发现岛上存在致病性正调控分子开关将位于89K上的二元调控系统SalK/SalR敲除，细菌就失去了致病能力，其互补株又可恢复高致病性，表明该调控系统为该菌高致病全局性正调控分子开关（PLoSOne，IF4．41）。

4．发现岛上的IV型分泌系统介入该菌致STSS发病机制实验证明89K上的Ⅳ型分泌系统可跨膜转运特定效应蛋白，引发宿主炎症因子瀑布效应，是该菌造成免疫损伤和STSS的重要机制（JInfectDis，IF6．29）。2、3、4项发现从基因组成和功能上证明89K序列为毒力岛，命名为PAI89K．

5．发现PAI89K获得和扩散的分子机制发现该菌可通过其染色体上的特异性整合酶位点以极低频率自然发生整合而获得PAI89K，也可通过切离、环化使PAI89K转移至其他不含PAI89K的SS2菌株，实现基因水平转移。岛编码的Ⅳ型分泌系统是上述分子事件的物质基础。该发现为该病的流行和流行终止作出了解释（MolMicrobiol，IF5．63）。

6．发现致病性负调控分子开关，发现超级致病菌株基因敲除证明，细菌自身基因组的CovR基因是该菌高致病的负调控基因，细菌通过该基因对外来毒力岛的致病性进行调控，以期达到适应新宿主生境，长久生存下去的目的；通过对高致病菌株进行遗传改造，获得毒力成百倍增强的超级毒力菌株，动物被接种后9小时暴毙，腹腔内广泛出血、凝血，多发性脏器坏死，该菌遗传稳定，对环境抵抗力强，表明其对公共健康更具威胁，特别是有用于生物战和生物恐怖的潜能（JBacteriol，IF4．17）。

7．发现保护性蛋白从全基因组出发，运用反向遗传学和构建基因组文库筛选体内诱导表达基因两种策略，经逐级递减筛选，获得烯醇化酶、胞外蛋白RfeA、表面抗原ESA等5个具有免疫保护作用的菌体蛋白，用其制备的单抗和多抗对受到致死性攻击的实验动物表现出良好的免疫保护作用，为STSS应急救治提供了手段（JInfectDis，IF6．04；InfectImmun，IF4．21）。

8．发现一组重要蛋白的结构和功能系统解析了锌离子结合蛋白、表面蛋白Sao、SortaseA、密度感应分子luxS等10多种蛋白分子的结构特性和功能，为新药和分子疫苗研制寻找到靶位（PLoSOne，IF4．35；JBacteriol，IF4．17；ProtSci，IF2．94）。

9．发现活疫苗菌株从健康猪扁桃体分离到SS2无毒株，完成了菌株的分离鉴定、测序、基因组功能注释、遗传进化和免疫特性研究，证明该菌株不仅具有良好的免疫保护作用，而且在遗传上不会发生毒力返祖，也不会获得毒力岛，为动物用活疫苗的研究提供了菌株（获国家发明专利）。

10．创建了检测、分型平台该平台包括多重PCR，基因芯片，免疫学检测等多种技术，可以实现对猪链球菌种、型和主要毒力因子，特别是PAI89K携带情况的检测和鉴定，对该病的流行病学调查，疫情预测，临床诊断发挥了重要作用。

三、项目推广应用情况

1．本项研究成果在江苏、安徽、浙江、四川、重庆等多个SS2疫区的临床诊断、疫情监测、SS2毒力因子和89K毒力岛携带情况的流行病学调查中得到广泛应用。特别是在2005年6～8月份，四川省资阳、成都等市县发生不明原因疫病时，农业部专家应用本项目创建的技术平台进行现场检测，数小时内将病原体锁定为SS2，为早期制订科学的防制措施，及时扑灭疫情，稳定社会情绪做出了贡献，受到国家卫生部和资阳市政府表彰。

2．本项目共发表论文78篇，其中被SCI数据库收录25篇，IF>4的11篇，在SCI数据库中共被引用277次，其中他引165次。获国家发明专利1项。

3．培养博士研究生15人，硕士研究生25人。

4．共参加国际学术会议交流25人次。