项目名称：HIV－1ThaiB亚型毒株的感染性克隆及其与APOBEC3G蛋白的相互作用研究

完成单位：军事医学科学院微生物流行病研究所、河南省疾病预防控制中心、河南省确山县疾病预防控制中心

完成人：李敬云、李林、王铮、刘永健、鲍作义、王哲、庄道民、李韩平、刘思杨、李宏、

一、项目概况：

本项目得到国家自然科学基金（APOBEC3G蛋白和HIVVif与HIV异性性传播及致病的相关性研究，编号30471496）的资助，研究历时5年（2002年10月至2007年12月），采用流行病学、分子病毒学、免疫学、蛋白质组学等多种研究方法，针对在我国广泛流行的HIV－1ThaiB亚型毒株，以毒株的感染性克隆及其与APOBEC3G蛋白的相互作用为核心，沿着两条技术路线开展了系列研究，一是构建毒株的感染性克隆并验证其在疫苗研究中的应用效果；二是在毒株流行的地区以HIV一方阳性的夫妻和HIV感染不同进展阶段的病例为研究对象，目的在于探索毒株与APOBEC3G蛋白的相互作用及稳定APOBEC3G蛋白的抗病毒策略，丰富对HIV－1ThaiB毒株与宿主细胞相互作用的认识、提供针对我国广泛流行的HIV－1ThaiB亚型毒株实用的研究工具。

二、项目研究结果及结论

本项目的主要研究结果包括：1）构建了HIV－1ThaiB亚型毒株的感染性克隆，经鉴定证实恢复病毒具有良好的生物学活性；以构建的感染性克隆和其他毒株为材料，构建3种我国主要HIV－1流行毒株的DNA载体，采用DNAPrime＋ProteinBoost策略免疫新西兰大白兔，评价了免疫后兔血清针对几种假病毒和实验室毒株的中和能力，发现多价DNA免疫后兔血清的中和能力和中和谱宽度明显优于单价DNA免疫，本研究构建的感染性克隆能够用于疫苗制备和免疫效果评价。3）制备了APOBEC3G和vif蛋白及单克隆抗体，用Ni－NTApulldown技术验证了APOBEC3G蛋白与vif的相互作用。4）在HIV－1ThaiB亚型流行的地区建立HIV－1一方阳性的夫妻队列，定期随访、访谈及收集血液样本；得到了我国中部农村具有稳定婚姻关系的夫妻中HIV异性性传播的概率，收集了HIV传播效率不同、HIV疾病进展速率不同的宝贵样本。分析APOBEC3G蛋白和HIV－1vif的基因多态性及mRNA表达水平与HIV异性性传播和疾病进展的关系，发现HIV感染长期不进展者、缓慢进展者、HIV高危暴露者和健康人外周血淋巴细胞的APOBEC3GmRNA表达水平存在差异，HIV长期不进展者和缓慢进展者CD4细胞数与APOBEC3GmRNA水平无相关性。检测到4个中国人APOBEC3G基因的SNPs位点，分别是6136C、6150T/C、6325A和6197C。其中6197C是本研究新发现的SNP位点。我国HIV－1ThaiB流行毒株的Vif基因具有相对保守性，其特征性区域和氨基酸基序对于保持Vif的功能十分重要。5）以裂殖酵母为模型，确定APOBEC3G蛋白主要定位于细胞浆、UBA2结构域能够稳定APOBEC3G蛋白、减少Vif介导的APOBEC3G降解并降低包装病毒的感染性。为以APOBEC3G蛋白为靶标的抗HIV药物或疫苗研究提供了新的理论基础。6）利用蛋白质组学方法，分析了MT4细胞感染HIV前后的蛋白表达差异，发现感染和未感染HIV的MT4细胞有40个蛋白质点差异，HIV感染后减少的蛋白质点有12个，增多的有28个，通过质谱分析，鉴定了29个蛋白质。其中HIV感染后下调的有能量代谢相关蛋白、肌动蛋白相关蛋白及假想蛋白等；上调的有肌动蛋白、酶类蛋白、免疫蛋白及假想蛋白等。本项目的特点：一是直接针对我国的HIV流行毒株制备感染性克隆；二是在人群水平验证APOBEC3G与HIV传播和致病的关系；三是采用多种先进的研究方法，提出了藉APOBEC3G靶点的新型抗病毒策略。

三、项目推广应用情况

本项目已经公开发表12篇论文，其中SCI收录2篇、其余均为中文核心期刊。培养博士研究生2名、硕士研究生1名。主要研究结果在2007年第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国家研讨会和在澳大利亚悉尼举办的第四届国际HIV病原学、治疗学及预防医学研讨会上交流。本项目制备APOBEC3G克隆已经赠送中国科学院两个课题组使用，效果良好。感染性克隆被美国LANLHIVDatabase收录。